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活體生物發(fā)光成像技術(shù)的*新進展(二）
日期：2025-05-07 07:37
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摘要：
有幾種常用的熒光素酶？特性如何？
有兩種常用的熒光素酶，luciferase 和renilla的熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是luciferin，后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長在540-600nm，后者所發(fā)的光波長在460-540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織。后者在體內(nèi)的代謝比前者快，但由于coelentarizine的原因，會有一些非特異性發(fā)光。所以，通常使用前者用作報告基因。
熒光素酶的發(fā)光特性如何？
熒光素腹腔注射老鼠后約一分鐘后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，十分鐘后強度達到*高。在*高點持續(xù)約法20-30分鐘后開始衰落，約三小時后熒光素排除，發(fā)光全部消失。所以，*好的檢測時間是在注射后15到25分鐘之間。
熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光？
熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素(LUCIFERIN)。熒光素是一種水溶性和脂溶性都非常好的小分子，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。
如何保證熒光素酶(Luciferase)的穩(wěn)定性？
熒光素酶基因是插到細胞染色體內(nèi)的，當(dāng)細胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時,熒光酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達。熒光素酶的半衰期約三個小時, 所以只有活細胞才能夠持續(xù)表達熒光素酶。
標(biāo)記的腫瘤接種以后，會發(fā)生luciferase的丟失嗎？
從理論上會，但是還沒有正式的報道。丟失的量，非常小，可以忽略不記，不會影響實驗結(jié)果。當(dāng)腫瘤傳很多代長很大時，已經(jīng)有很多細胞死亡，不具有觀察的意義。
如何定量分析？
采取**光子數(shù)的計算方法，記錄單位時間內(nèi)、單位面積、單位角度接受到的光子數(shù)。這樣，不同時間、不同儀器的測量結(jié)果可以進行比較，具有**的定量意義。每一個新標(biāo)記的細胞株都要進行**的定量分析才能用于定量實驗，其中包括在體外和體內(nèi)固定位置細胞發(fā)光的標(biāo)準(zhǔn)曲線。提供的每一種熒光酶標(biāo)記的細胞株都做過****的分析。我們也為客戶免費提供這些分析的方法。
儀器的解析度如何？分辨率如何？
儀器的*高解析度在0.1毫米左右。*新的儀器IVIS 200的*高解析度可達到60um,在體外可觀察到單個發(fā)光細胞。由于可見光是漫射光，在體內(nèi)走的路線不是直線，所以該儀器的體內(nèi)光源的分辨率不是很好，通過該儀器觀察的發(fā)光圖片不能代表發(fā)光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，在動物體表所捕捉的發(fā)光信號只能代表發(fā)光的強度和大概的位置。小動物CT和MRI，在這方面具有優(yōu)勢，因為放射線走的路線很直。
發(fā)光的波長與體內(nèi)的穿透性如何關(guān)系？
熒光素酶發(fā)出的光主要是偏紅光，與綠色熒光蛋白(GFP)的綠色熒光不同。熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強近一百倍。因為光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域,大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。
可以用熒光素酶基因標(biāo)記干細胞嗎？如何標(biāo)記？
可以，標(biāo)記干細胞有兩種方法。一種是標(biāo)記組成性表達的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，干細胞就被標(biāo)記了，從此小鼠的骨髓取出造血干細胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術(shù)示蹤造血干細胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過程。另外一種方法是用慢病毒標(biāo)記干細胞。以上內(nèi)容都有相關(guān)的文獻報道。
該技術(shù)在抗腫瘤新藥研究方面的應(yīng)用如何？
在用該技術(shù)進行抗腫瘤新藥的研究方面，主要是藥效學(xué)評價。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術(shù)有更高的靈敏度，當(dāng)用傳統(tǒng)的方法，還不能檢測到瘤塊時，用該技術(shù)已經(jīng)可以檢測到很強的信號。還有由于該技術(shù)只是檢測活躍的細胞，那些已經(jīng)凋亡的癌細胞是檢測不到的，而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常的癌細胞與凋亡的癌細胞，所以該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更早的發(fā)現(xiàn)**的療效，比傳統(tǒng)方法更靈敏。目前已經(jīng)應(yīng)用該技術(shù)進行的抗腫瘤藥效研究的有SU11248（很可能上市的乳腺癌新藥），Topotecan（已經(jīng)上市的抗腫瘤新藥）等。
